[ Pobierz całość w formacie PDF ]
.Jednym z nich jest operator tetracyklinowy (tetO) kierujący aktywnością minimalnegopromotora CMV, który kontroluje transkrypcję badanego genu.Drugim elementem jestreceptor tetracyklinowy (kodowany przez osobny gen), który przyłączając się do operato-ra indukuje ekspresję badanego genu.Receptor występuje w dwóch postaciach: jakotransaktywator tetracyklinowy (tTA), który pod wpływem tetracykliny odłącza się od ope-ratora, hamując ekspresję oraz jako odwrotny transaktywator tetracyklinowy (rtTA), którydopiero po związaniu antybiotyku wiąże się do operatora i aktywuje transkrypcję (ryc.12).Tym sposobem badany gen może być włączany i wyłączany niejako na żądanie poprzezpodawanie zwierzęciu antybiotyku.Zamiast tetracykliny stosuje się obecnie doksycyklinę,która ma dłuższy okres półtrwania i działa efektywniej nawet przy niższych, nietoksycz-nych stężeniach.Wygenerowano pokazną liczbę zwierząt posiadających w swoim genomieróżne receptory tetracyklinowe pod kontrolą różnych promotorów mniej lub bardziejtkankowo specyficznych.Podobnie jak dla zwierząt posiadających geny Cre i FLP, możnawykorzystywać istniejące linie transgeniczne z receptorem tetracyklinowym do uzyskanianowych zwierząt posiadających indukowalną w dowolny sposób ekspresję badanego genu.Co ciekawe, wykorzystuje się już obecnie system tetracyklinowy do załączania ekspresjirekombinazy Cre.IV.Transgeneza zagadnienia ogólne61Ryc.12.Schemat działania systemu tetracyklinowego.W wersji Tet-ON odwrotny transaktywator tetracy-klinowy (rtTA) wiąże tetracyklinowy element regulacyjny (TRE), zbudowany z siedmiu tandemowychpowtórzeń sekwencji tetO, jedynie w obecności doksycykliny (Dox, czerwony trójkąt).Tym samym akty-wuje transkrypcję badanego genu X.W wersji Tet-OFF transaktywator tetracyklinowy (tTA) wiąże ele-ment TRE, aktywując ekspresję genu X.Dodanie doksycykliny (lub tetracykliny) powoduje odłączaniereceptora tetracyklinowego od promotora i hamowanie transkrypcji.P promotor wirusa CMV,CMVP minimalny promotor wirusa CMV, VP16 domena aktywacji wirusa HSV.CMVminSystem Gal4Pochodzący od drożdży system regulacyjny opiera się na oddziaływaniu transakty-watora Gal4, który aktywuje ekspresję po przyłączeniu się do sekwencji regulacyjnychzwanych UAS (upstream activating sequence).Induktorem w warunkach naturalnych u droż-dży jest galaktoza.System ten zmodyfikowano przez połączenie domeny wiążącej DNAbiałka Gal4 z domeną aktywacji VP16 wirusa HSV oraz domeną wiążącą ligand receptoraprogesteronu (system GLVP).Podobnie zmodyfikowano ten system, stosując receptorestrogenowy.W stanie nieaktywnym GLVP pozostaje w cytoplazmie związane z białkamiHSP.Dodanie syntetycznego sterydu RU486 uwalnia białka HSP i powoduje translokacjęGLVP do jądra, gdzie wiąże on sekwencje UAS, aktywując transkrypcję badanego genu.Omawiany system ma ograniczone zastosowanie w transgenezie ze względu na koniecz-ność podawania hormonów: RU486 ze względu na właściwości aborcyjne oraz estroge-nów z powodu wywoływanych efektów plejotropowych.Inżynieria genetyczna i terapia genowa.Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne62System ekdyzonowyW systemie tym zmieniono owadzi receptor hormonu sterydowego ekdyzonu,wprowadzając do niego domenę aktywacji VP16.Aby receptor ten przyłączał się do se-kwencji docelowej w DNA pod wpływem podawanego analogu ekdyzonu, konieczna jestjego heterodimeryzacja z homologiem ssaczego receptora retinoidowego (RXR).Sekwen-cja DNA, do której wiąże się taki kompleks, też została odpowiednio zmodyfikowana.Zewzględu na udział receptora retinoidowego w tym układzie regulacyjnym istnieje niebez-pieczeństwo wystąpienia efektów plejotropowych w komórkach ssaków.5.Genotypowanie zwierząt transgenicznychUtrzymanie i poszerzenie hodowli zwierząt transgenicznych wymaga stałego nadzo-ru nad dziedziczeniem wprowadzonego transgenu
[ Pobierz całość w formacie PDF ]